怎样使用Mfuzz进行时间序列表达模式聚类分析，很多新手对此不是很清楚，为了帮助大家解决这个难题，下面小编将为大家详细讲解，有这方面需求的人可以来学习下，希望你能有所收获。

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在之前的文章中，我们介绍了STEM软件，针对时间序列的数据，可以进行基因表达模式聚类分析。这里介绍另外一个功能相同的R包Mfuzz。这个R包的地址如下

https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Mfuzz.html

Mfuzz采用了一种新的聚类算法fuzzy c-means algorithm，在文献中称这种聚类算法为soft clustering算法，相比K-means等hard clustering算法，一定程度上降低了噪声对聚类结果的干扰，而且这种算法有效的定义了基因和cluster之间的关系，即基因是否属于某个cluster, 对应的值为memebership。

对于分析而言，我们只需要提供基因表达量的数据就可以了，需要注意的是，Mfuzz默认你提供的数据是归一化之后的表达量，这意味着表达量必须可以直接在样本间进行比较，对于FPKM, TPM这两种定量方式而言，是可以直接在样本间进行比较的，但是对于count的定量结果，我们必须先进行归一化，可以使用edgeR或者DESeq先得到归一化之后的数据在进行后续分析。

假设你已经有归一化之后的表达量了，通过以下几个步骤就可以得到聚类的结果

1. 预处理

预处理包括读取数据，去除表达量太低或者在不同时间点间变化太小的基因等步骤，代码如下

x <- read.table(
"normalisation.count.txt",
row.names = 1,
sep = "\t",
header = T)
count <- data.matrix(x)
eset <- new("ExpressionSet",exprs = count)
# 根据标准差去除样本间差异太小的基因
eset <- filter.std(eset,min.std=0)

需要注意的是，Mfuzz聚类时要求是一个ExpressionSet类型的对象，所以需要先用表达量构建这样一个对象。

2. 标准化

聚类时需要用一个数值来表征不同基因间的距离，Mfuzz中采用的是欧式距离，由于普通欧式距离的定义没有考虑不同维度间量纲的不同，所以需要先进行标准化，代码如下

eset <- standardise(eset)

3. 聚类

Mfuzz中的聚类算法需要提供两个参数，第一个参数为希望最终得到的聚类的个数，这个参数由我们直接指定；第二个参数称之为fuzzifier值，用小写字母m表示，可以通过函数评估一个最佳取值，代码如下

# 聚类个数
c <- 6
#  评估出最佳的m值
m <- mestimate(eSet)
# 聚类
cl <- mfuzz(eSet, c = c, m = m)

在cl这个对象中就保存了聚类的完整结果，对于这个对象的常见操作如下

# 查看每个cluster中的基因个数
cl$size
# 提取某个cluster下的基因
cl$cluster[cl$cluster == 1]
# 查看基因和cluster之间的membership
cl$membership

4. 可视化

代码如下

mfuzz.plot(
eSet,
cl,
mfrow=c(2,3),
new.window= FALSE)

生成的图片如下

对于感兴趣的表达模式，可以用上述提到的用法提取出该cluster下的基因列表，通过GO/KEGG等功能富集分析进行深入挖掘。

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