首先熟悉 clinvar 数据库

ClinVar是NCBI主办的与疾病相关的人类基因组变异数据库。它的强大在于整合了dbSNP、dbVar、Pubmed、OMIM等多个数据库在遗传变异和临床表型方面的数据信息，形成一个标准的、可信的遗传变异-临床相关的数据库。

clinvar的注释，可以寻找出对应的基因变异信息，发生频率，表型，临床意义，评审状态以及染色体位置等。

首先，我们去clinvar数据库的ftp里面找到数据库文件，然后下载最新版文件，我这里用的是shell命令：

## ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/
mkdir -p ~/annotation/variation/human/clinvar
cd ~/annotation/variation/human/clinvar
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/disease_names
# mkdir vcf_GRCh47 && cd vcf_GRCh47
mkdir vcf_GRCh48 && cd vcf_GRCh48
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/vcf_GRCh48/clinvar_20200706.vcf.gz
wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/vcf_GRCh48/clinvar_20200706.vcf.gz.tbi

这个 ClinVar数据库里面的变异位点记录更新还是蛮快的。

然后熟悉SnpSift 软件

SnpSift 软件非常强大，推荐大家仔细阅读它的说明书，http://snpeff.sourceforge.net/protocol.html

• Example 1: Coding variants
• Example 2:Software Integration
• Example 3: Non-Coding variants
• Example 4: Sequencing data analysis
• Example 5: Filter variants (dbSnp)
• Example 6: Custom annotations

如果要使用SnpSift把vcf文件的变异位点注释到clinvar数据库，我们需要使用的命令示例是：

java -Xmx1g -jar ~/biosoft/snpEff/snpEff/SnpSift.jar  \
    annotate \
    -v  ~/annotation/variation/human/clinvar/clinvar_20200706.vcf.gz  \
    new.filter.sort.vcf  \
    > new.clinvar.vcf

一般来说，注释比例并不会太高，因为clinvar数据库记录的位点很有限，如下：

Total annotated entries : 6231
 Total entries           : 54972
 Percent                 : 11.33%

如果选择其它数据库，比如dbSNP、exac、gnomad注释比例会高很多。

解读clinvar数据库注释结果

实际上，没办法解读，一般来说， WES数据分析结果有10万个变异位点，其中2万左右在外显子区域，那么就会有2千个左右的位点被clinvar注释到，这个数量级仍然是很可观的。

我们必须要有先验知识，比如知道这个WES数据来源的个体是患有某种疾病的，比如，视网膜变性相关疾病就可以搜索：

"Pigmentary retinal degeneration"
"Rod-cone dystrophy"
"Retinitis pigmentosa"

如果你发现搜索到的突变，都是Benign，没有Pathogenic，就比较麻烦，就需要根据ACMG指南分类分析，重点看：

• 1、PM1: 位于热点突变区域, 和/或位于已知无良性变异的关键功能域(如酶的活性位点).

• 2、PM2: ESP 数据库、千人数据库、 EXAC 数据库中正常对照人群中未发现的变异(或隐性遗传病中极低频位点)

• 3、PP1: 突变与疾病在家系中共分离(在家系多个患者中检测到此变异). 注: 如有更多的证据, 可作为更强的证据.

• 4、PP3: 多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物造成有害的影响, 包括保守性预测、进化预测、剪接位点 影响等. 注: 由于做预测时许多生物信息学算法使用相同或非常相似的输入, 每个算法不应该算作一个独立的标准.

如果这样缩小范围仍然是位点很多，可以直接缩小到基因，比如查询 "Retinitis pigmentosa" 这个疾病相关基因就37个，这样位于这些基因的突变就很少了，从这里面挑选那些有害突变，而且人群频率低的。但是其实有一个问题，既然已经局限于具体的疾病相关基因了，那么为什么还有做WES呢，直接上一个panel不就好了吗？见：家系外显子研究最后反正要定位到已知疾病相关基因

关于ACMG指南分类分析，建议看Germline pathogenic variants of 11 breast cancer genes in 7,051 Japanese patients and 11,241 controls文章的材料与方法部分，主要是很多细致的探索，很有意思。

另外推荐clineff软件

主页是：http://www.dnaminer.com/clineff.html